Определение содержания общего билирубина и его фракций в сыворотке крови

Работа № 2. Определение концентрации общего билирубина и его фракций (неконъюгированного и конъюгированного билирубина) в сыворотке крови по Йендрашику

Клинико-диагностическое значение: Определение общего билирубина и его фракций (некоъюгированного и конъюгированного билирубина) в сыворотке крови и уробилиногена в моче относится к обязательным биохимическим исследованиям при диагностике заболеваний печени, так как позволяет установить уровень нарушения пигментного обмена и дифференциально диагностировать желтухи.

Содержание общего билирубина (БРобщ) в сыворотке крови в норме составляет 8,5-20,5 мкмоль/л (0,5-1,2 мг%), из них 75% приходится на долю свободного (неконъюгированного) билирубина (БРнекон).

Гипербилирубинемия (повышение концентрации БР в сыворотке крови) — является результатом нарушения динамического равновесия между скоростью образования и выделения БР и может быть вызвана различными причинами (гемолиз, цитолиз, холеотаз).

Повышение концентрации БР в сыворотке крови до 28мкмоль/л и более сопровождается желтушной окраской кожных покровов, слизистых оболочек склер глаз т.е. желтухой (за счет отложения в тканях диффундирующего из крови БР).

Принцип метода: Общий билирубин сыворотки крови (БРнекон. и БРкон.) определяется на основе реакции с диазореактивом (диазотированной сульфаниловой кислотой) после диссоциации комплекса альбуминов плазмы и БРнекон, в присутствии кофеинового реактива и перехода БРнекон в растворимое состояние. БРкон (растворимый) дает с диазореактивом розовое окрашивание сразу (без кофеинового реагента).

Интенсивность окрашивания исследуемого раствора пропорциональна концентрации азобилирубина в сыворотке крови и оценивается колориметриметрически на ФЭКе.

Концентрация БРнекон определяется расчетным путем как разность между концентрациями БРобщ и БРкон.

Работа № 1 Исследование концентрации холестерина в периферической крови у людей разного возраста.

Принцип метода. При гидролизе эфиров холестерина холестеролэстеразой образуется свободный холестерин. Образовавшийся и имеющиеся в пробе холестерин окисляются кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина в пробе.

Работа № 2. Исследование концентрации общего белка в периферической крови.

Принцип метода.Белок образует окрашенный комплекс с ионами меди в щелочной среде.

Работа № 1. Качественное определение ацетальдегида в моче при отравлении этанолом.

Принцип метода: Ацетальдегид с фуксинсернистой кислотой образует комплекс фиолетового цвета.

Работа № 2. Качественное определение фенола в моче.

Принцип метода: Лекарственные препараты (производные салициловой кислоты и ПАСК), ароматические углеводороды частично обезвреживаются в печени с образованием гидроксила в бензольном кольце. В гидроксилированной форме они попадают в мочу и с хлорным железом дает красно-фиолетовое окрашивание.

Работа № 3. Качественное определение малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты.

Принцип метода: Малоновой диальдегид (МДА) является конечным продуктом перекисного окисления липидов в клетке. Увеличение его концентрации свидетельствует об увеличении липидной пероксидации в организме, вызванной радиоактивным излучением

Работа № 4. Качественное определение пролина в моче.

Принцип метода: Пролин одна из основных аминокислот белка соединительной ткани — коллагена. При увеличении фиброзного процесса в тканях увеличивается концентрация его в крови и моче. Пролин при высокой температуре образует в изотиновом растворе ярко-голубой комплекс.

По материалам lektsii.org

Принцип метода. Связанный билирубин при взаимодействии с диазореактивом (диазофенилсульфоновая кислота) образует розовое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. Кофеиновый реактив переводит несвязанный билирубин в растворимое состояние, благодаря чему он также реагирует с диазореактивом, образуя розовое окрашивание. По интенсивности этого суммарного окрашивания определяют концентрацию общего билирубина. А концентрацию не связанного билирубина определяют как разность между общим и связанным билирубином.

Ход работы. В 3 пробирки приливают реактивы по схеме:

Через 5-10 мин после прибавления диазореактива колориметрируют пробу на связанный билирубин (при более длительном стоянии пробы в реакцию вступает несвязанный билирубин, что искажает результат). Пробу на общий билирубин колориметрируют через 20 мин после добавления диазореактива. Колориметрирование проводят при зеленом светофильтре в кювете толщиной 0,5 см против контроля. Концентрацию общего и связанного билирубина определяют по калибровочному графику.

Нормальное содержание билирубина в сыворотке: общий – 1,7-20,5 ммоль/л, связанный – 0,86-4,3 мкмоль/л, свободный – 1,7-17,1 мкмоль/л.

Диагностическое значение определения билирубина в сыворотке крови.

Причины, вызывающие гипербилирубинемию, различны. Желтуха появляется, когда уровень билирубина в крови превышает 43 мкмоль/л. Заболевания, вызывающие повышение связанного билирубина: вирусный гепатит, цирроз печени, опухоль печени и метастазы, жировая дистрофия.

Заболевания, вызывающие повышение несвязанного билирубина: гемолитическая анемия, пернециозная анемия, желтуха новорожденных.

Вопросы к защите лабораторной работы:

Объясните термины: общий билирубин, свободный билирубин, связанный билирубин, прямой билирубин, непрямой билирубин, конъюгированный билирубин, некоъюгированный билирубин.

Как образуется свободный билирубин?

Зачем в данном методе используется кофеиновый реактив?

Почему пробу на связанный билирубин колориметрируют точно через 5-10 минут?

Каков принцип метода определения билирубина в сыворотке крови?

Как определяют концентрацию общего и связанного билирубина?

Назовите причины гипербилирубинемии.

Какова норма свободного, связанного и общего билирубина?

Для оценки состояния порфиринового обмена используют определение пигмента билирубина, являющегося продуктом распада гемпротеидов. Существуют два типа билирубина: неконъюгированный (свободный, который с диазореактивом дает непрямую реакцию, т.е. после растворения в этаноле) и конъюгированный (связанный с глюкуроновой кислотой, который сразу реагирует с диазореактивом). По соотношению фракций билирубина судят об изменении пигментного обмена.

Реактивы. Кофеиновый реактив*; хлорид натрия, 9 г/л раствор; диазореактив*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; ФЭК.

Метод основан на способности связанной и диссоциированной формы свободного билирубина давать при взаимодействии с диазофенилсульфоновой кислотой азобилирубин розовато-фиолетового цвета. Свободный билирубин переводится в растворимое диссоциированное состояние кофеиновым реактивом, благодаря чему в этой пробе определяется общий билирубин. По разнице между общим и связанным билирубином находят концентрацию свободного билирубина.

Ход определения. В три пробирки вносят согласно таблице необходимые ингредиенты и тщательно перемешивают.

При определении общего билирубина пробы оставляют стоять на 20 мин для развития окраски, а связанного – на 5-10 мин (при длительном стоянии в реакцию вступает свободный билирубин).

По истечении указанного времени фотометрируют каждую пробу против воды на ФЭКе при 520-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет. Из полученных экстинкций общего и связанного билирубина вычитают экстинкцию контрольной пробы (контроль на мутность сыворотки) и находят по ним содержание общего и связанного билирубина (в мкмоль/л) по калибровочному графику (рис. 11). Свободный (неконъюгированный) билирубин рассчитывают по разнице между величинами общего и связанного билирубина.

Оформление работы. Рассчитать содержание общего билирубина и его фракций в сыворотке крови и сделать вывод о причине возможных отклонений этих показателей в исследуемом материале.

Практическое значение работы. В норме концентрация общего билирубина в сыворотке крови составляет 8,0-20,0 мкмоль/л; из этого количества 75% приходится на долю неконъюгированного (свободного) билирубина (6,0-15,0 мкмоль/л) и 25% – на долю конъюгированного (связанного) билирубина (2,0-5,0 мкмоль/л). Исследование содержания билирубина проводится в клинике для дифференциальной диагностики желтух. Желтушная окраска кожных покровов проявляется при уровне билирубина в крови выше 27 мкмоль/л. При надпеченочных желтухах (гемолитические анемии, желтуха новорожденных и др.) увеличивается содержание свободного билирубина в крови, при печеночных желтухах, возникающих вследствие поражения собственно клеток печени, повышается концентрация связанного билирубина в крови, а при подпеченочных желтухах, к которым относится механическая, наблюдается возрастание уровня как свободного, так и, в большей степени, связанного билирубина.

Ход работы. К 1 мл сыворотки крови прибавить 3,5 мл физраствора и 0,5 мл диазореактива. Через 5 минут полученную смесь помещают в кювету с толщиной 1 см и фотометрирует на ФЭКе при зеленом светофильтре против компенсационного раствора, содержащего 1 мл сыворотки, 3,5 мл физраствора и 0,5 мл воды. Норма: общий — 8,2-20,5 мкмоль/л или 0,5-0,9 мг% (75%-непрямой от общего билирубина);

Клинико-диагностическое значение. Повышение концентрации билирубина в крови до 20 мг/л приводит к развитию желтухи. Боле высокий уровень билирубина в крови вызывает явление тяжелого отравления. В крови количество и соотношение между прямым и непрямым билирубином резко меняются при поражениях печени, селезенки, костного мозга, болезнях крови и т.д., поэтому определение обеих форм билирубина в крови имеет существенное значение в клинике при дифференциальной диагностике желтух различной этиологии.

По материалам zna4enie.ru

Количественное определение билирубина и его фракций в сыворотке крови по методу Иендрашика, Клеггорна и Гроффа

Задание 1.Определить содержание общего, связанного и свободного билирубина в сыворотке крови методом Иендрашика, Клеггорна и Гроффа.

Принцип. Метод базируется на способности связанной и диссоциированной формы свободного билирубина образовывать при взаимодействии с диазофенилсульфоновой кислотой азобилирубин розово-фиолетового цвета. Свободный билирубин переводится в растворимое диссоциированное состояние кофеиновым реактивом, благодаря чему в этой пробе определяется общий билирубин. По разности между общим и связанным билирубином находят концентрацию свободного.

Ход работы. В три пробирки вносят, в соответствии с таблицей, необходимые ингредиенты и тщательно перемешивают.

При определении общего билирубина пробы оставляют стоять на 20 мин для развития окраски, а связанного — на 5-10 мин (при более продолжительном стоянии в реакцию вступает свободный билирубин). По окончании указанного времени фотометрируют каждую пробу против воды на ФЭК при длине волны 520-560 нм (зеленый светофильтр) в 5 мм кювете. Из полученных экстинкций общего и связанного билирубина отнимают экстикцию контрольной пробы (контроль на мутность сыворотки) и находят содержание общего и связанного билирубина (в мкмоль/л) по калибровочному графику. Свободный билирубин рассчитывают по разности между количеством общего и связанного. Рассчитывают содержание общего билирубина и его фракций в сыворотке крови и делают вывод о причинах возможных отклонений этих показателей.

Клинико-диагностическое значение. В норме содержание общего билирубина в сыворотке крови составляет 4,0-21,0 мкмоль/л; из этого количества 75% приходится на долю свободного билирубина (6,0-15,0 мкмоль/л) и 25% на долю связанного (2,0-5,0 мкмоль/л). К основным факторам, которые вызывают нарушение обмена жёлчных пигментов, принадлежат: повышенный гемолиз эритроцитов, нарушение синтеза билирубинглюкуронидов, нарушение выделения связанного билирубина из гепатоцитов в жёлчные капилляры (деструкция гепатоцитов), нарушение жёлчевыделения вследствие обтурации внепечёночных жёлчевыводящих путей. Паренхиматозная желтуха возникает при гепатитах, циррозах печени и характеризуется резким повышением содержания связанного билирубина в крови. В печени снижается образование билирубинглюкуронида, вследствие этого содержание свободного билирубина в крови также увеличивается. Гемолитическая желтуха возникает при усиленном гемолизе эритроцитов, что приводит к усилению образования свободного билирубина, так как печень не успевает его связывать. Увеличение концентрации связанного билирубина в случае обтурационной желтухи обусловлено перенаполнением жёлчных путей вследствие закупорки, разрыва и в дальнейшем переходе компонентов жёлчи в кровь; при этом в крови накапливается связанный билирубин (гипербилирубинемия), из мочи исчезает уробилиноген, однако вследствие билирубинурии она приобретает тёмную окраску, а из кала исчезает стеркобилин. В клинико-биохимических лабораториях проводят определение содержания билирубина и его фракций для дифференциальной диагностики желтух.

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 462-467.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 577-584.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 562-566.

4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 506-508, 561-565.

5. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 645-655.

6. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 209-212.

Тема: Биохимия почек и мочи. Физико-химические свойства и химический состав мочи в норме. Биохимическое исследование мочи.

Актуальность. Почки — один из важнейших органов, основное назначение которого заключается в поддержании динамического постоянства внутренней среды организма. Почки принимают участие в регуляции водно-электролитного баланса, кровяного давления, поддержке кислотно-щелоч-ного состояния, осмотического давления жидкостей организма; стимуляции эритропоэза и др. Почки вырабатывают мочу из компонентов плазмы крови. С мочой выделяется до 150 разных веществ. В суточной моче содержится в среднем около 40 г органических веществ и приблизительно 20 г неорганических. Биохимическое исследование мочи играет важную роль в клинике для диагностики и прогноза заболевания, контроля эффективности лечения.

Цель. Ознакомиться с основными физико-химическими свойствами мочи (диурез, рН, плотность, цвет, прозрачность, запах) и химическим составом нормальной мочи. Ознакомиться с методами клинического и биохимического анализа мочи. Запомнить некоторые физико-химические константы и биохимические показатели мочи в норме с целью использования их для диагностики заболеваний, правильной оценки отклонений от нормы.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Функции почек и особенности обмена веществ в них.

2. Биохимические механизмы регуляции функции почек.

3. Общие свойства и химический состав нормальной мочи. Значение исследования в клинике.

4. Органическое и неорганическое вещества нормальной мочи. Их изменения в зависимости от возраста.

5. Физико-химические показатели мочи: диурез, относительная плотность, рН, запах, цвет, прозрачность. Значение их исследования. Возможные отклонения от нормы.

6. Клинико-диагностическое значение количественного и качественного анализа мочи.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. У спортсмена, который находился на диете с большим количеством белков, установлена кислая реакция мочи. Наличие каких веществ приводит к таким изменениям?

2. Прозрачность мочи является одним из параметров, которые оцениваются при её анализе. С наличием каких веществ может быть связано помутнение мочи, имеющей щелочную реакцию?

3. Почки выполняют все функции, кроме:

4. Органоспецифическим ферментом почек является:

5. В результате фильтрации плазмы крови в первичную мочу переходят все вещества, кроме:

6. Поддержание постоянства рН в организме с помощью почек осуществляется в процессе реабсорбции ионов Na + и секреции Н + . В основе их действия лежат все перечисленные химические процессы, за исключением:

A. Реабсорбция Na + во время преобразования двузамещённых фосфатов
в однозамещённые.

B. Избирательное всасывание ионов Na + в клетках канальцев взамен на
ионы Н + , идущих в просвет канальцев.

C. Диссоциация Н2СО3 на НСО3 — и Н + , последний выводится из организма. D.Задержке ионов Na + способствуют реакции образования аммиака и
использование его для нейтрализации кислых метаболитов.

E. Выведение мочевины с мочой.

7. Для диагностики заболевания мутную мочу с щелочной реакцией подкислили и подогрели. При этом осадок исчез. Чем обусловлена мутность мочи?

8. Какой из физико-химических показателей мочи зависит от диуреза?

А. Цвет. В. рН. С. Относительная плотность.

9. Какие из приведенных показателей рН и относительной плотности мочи взрослого человека отвечают норме?

10. Как можно определить патологическое состояние взрослого человека, у которого наблюдается прекращение выделения мочи?

А. Энурез. В. Олигурия. С. Анурия. D. Никтурия. Е. Дизурия.

11. Как можно определить патологическое состояние взрослого человека, у которого суточный диурез составляет 500 мл?

А. Анурия. В. Полиурия. С. Никтурия. D. Олигурия. Е. Поллакиурия.

12. Содержание аммиака в моче является важным показателем кислотно-щелочного состояния организма; количество аммиака повышается как при респираторном, так и метаболическом ацидозе. Это связано со стимуляцией при ацидозе синтеза в клетках эпителия почечных канальцев ферментов:

13. Больной, 45 лет, жалуется на неутолимую жажду, потребление большого количества жидкости (до 5 л), выделение значительного количества мочи (до 6 л в сутки). Концентрация глюкозы в крови составляет 4,4 ммоль/л, уровень кетоновых тел не повышен. Моча неокрашена, удельный вес 1,002; сахар в моче не определяется. Дефицит какого гормона может привести к таким изменениям?

A. Глюкагона. B. Альдостерона. C. Инсулина. D. Вазопрессина.

14. При лабораторном исследовании ребёнка выявлено повышенное содержание в моче лейцина, валина, изолейцина и их кетопроизводных. Моча имеет характерный запах кленового сиропа. Недостаточностью какого фермента вызваны данные изменения?

По материалам infopedia.su

В клинической практике используются различные методы определения билирубина и его фракций в сыворотке крови.

Наиболее распространенным из них является биохимический метод Ендрассика-Грофа

. Он основан на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. При этом связанный билирубин (билирубин-глюкуронид) дает быструю («прямую») реакцию с диазореактивом, тогда как реакция свободного (не связанного с глюкуронидом) билирубина протекает значтельно медленнее. Для ее ускорения применяют различные вещества–акселераторы, например кофеин (метод Ендрассика-Клеггорна-Грофа), которые освобождают билирубин из белковых комплексов («непрямая» реакция). В результате взаимодействия с диазотированной сульфаниловой кислотой билирубин образует окрашенные соединения. Измерения проводят на фотометре.

В 3 пробирки (2 опытные пробы и холостая) вводят реактивы, как указано в таблице. Диазореакция

Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5—10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют стоять 20 мин, после чего измеряют на фотометре. При дальнейшем стоянии окраска не изменяется. Измерение проводят при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы. Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина.Метод Ендрассика, Клеггорна и Грофа прост, удобен в практике, не связан с применением дефицитных реактивов и является наиболее приемлемым для практических лабораторий.Определение рекомендуется приводить сразу же после забора проб, чтобы избежать окисления билирубина на свету. Гемолиз сыворотки снижает количество билирубина пропорционально присутствию гемоглобина. Следовательно, сыворотка крови не должна быть гемолизирована.

Ряд веществ — гидрокортизон, андрогены, эритромицин, глюкокортикоиды, фенобарбитал, аскорбиновая кислота — вызывают интерференцию.

Постоение калибровочного графика при методе ендрассика.

Способ I — Шелонга-Вендес использованием стабилизирующего свойства белка сыворотки крови. Основной раствор билирубина: в колбе вместимостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30—35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия Na2CO3. Хорошо взбалтывают, не допуская образования пузырьков. Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором Nа2СО3 и несколько раз перемешивают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем происходит окисление билирубина. Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека добавляют 2 мл свежеприготовленного основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Хорошо перемешивают. При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в течение нескольких дней. Этот раствор содержит точно на 100 мг/л, или 171 мкмоль/л, билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке, при измерении на фотометре из величин экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости. Для приготовления компенсационной жидкости смешивают 13,9 мл той же сыворотки, которая использовалась для приготовления калибровочного раствора билирубина, 2 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина. К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора едкого натра. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 мин. Из компенсационной жидкости готовят разведения, аналогичные калибровочным (как указано ниже), и далее обрабатывают их так же, как калибровочные пробы.

Для определения билирубина и его фракций в плазме крови используются различные методы, наиболее распространенным из которых является метод Ендрашика-Грофа. Метод основан на взаимодействии билирубина с сульфаниловой кислотой и азотнокислым натрием. При этом связанный билирубин дает быструю реакцию, поэтому ему дали название прямого, а свободный – более медленную реакцию, для ускорения которой применяют различные вещества (кофеин, этанол, и др., которые сначала высвобождают билирубин из белковых комплексов), поэтому он называется непрямым.

Различные методы обнаружения билирубина в моче основаны на его превращении под действием окислителей в другие вещества, имеющие зеленую или красную окраску.

Для определениябилирубинаиспользуется колориметриче­ский метод, основу которого составляет реакция Ван ден Берга.

Реакция протекает в 2 стадии: на первой под воздействием соля­ной кислоты разрывается тетрапирроловая цепь, в результате чего образуются два дипиррола, на второй — оба дипирроловых производных диазотируются диазофенилсульфоновой кислотой с превращением их в азобилирубин.

Фракционное содержание билирубина определяется с помощью модифицированного мето­да Ван ден Берга, предложенного Ендрассиком.

По материалам studopedya.ru

Понравилась статья? Поделить с друзьями: