Определение мочевой кислоты в сыворотке крови и моче ферментативным методом

Принцип метода: метод основан на колориметрировании окрашенных продуктов, образующихся при восстановлении фосфорновольфрамового реактива мочевой кислотой.

Для определения в моче этап осаждения белка опускается.

Ход работы: в центрифужную пробирку налить 1,5 мл сыворотки крови,

добавить 1,5 мл 10% ТХУ + 1,5 мл воды. Через 10 минут смесь центрифугировать в течение 10 минут при 4000 об/мин. Затем в пробирку с отметкой 10 мл налить 1,5 мл центрифугата +0,7 мл насыщенного раствора соды

и добавляют 0,05 мл реактива Фолина. Довести объем жидкости до отметки дист. водой, перемешать и колориметрировать против воды с красным светофильтром. Содержание мочевой кислоты определяют по калибровочному графику.

Определение содержания мочевой кислоты в моче: 1,5 мл мочи + 0,7

мл соды + 0,05 мл реактива Фолина. Довести объем до 10 мл дист. водой.

Перемешать, колориметрировать на ФЭКе с красным светофильтром. Содержание мочевой кислоты определяют по калибровочному графику.

В моче мочевой кислоты в норме экскретируется 2 — 7 ммоль/сут

Норма содержания мочевой кислоты у взрослых — 0,12 — 0,24 ммоль/л (0,02 — 0,04 г/л, 2 — 4 мг/100мл) у детей — 0,6 ммоль/л.

Клиническое значение определения мочевой кислоты:

определение уровня этого метаболита (конечного продукта распада пуринов у человека) характеризует состояние пуринового обмена и интенсивность распада нуклеиновых кислот. Для правильной оценки этих показателей с целью исключения влияния пуринов алиментарного происхождения пациент должен в течение недели находиться на диете, обедненной содержанием нуклеопротеидов (исключить мясо, рыбу). Имеет значение обнаружение повышенных уровней мочевой кислоты в крови и моче.

Гиперурикемия почечного происхождения: наблюдается при поражении клубочков почки (острый и хронический нефрит, сморщенная почка). Причина — нарушается выделение мочевой кислоты с мочей. Гиперурикемия непочечного происхождения: наблюдается при подагре (связано с нарушением обмена нуклеотидов). Причина — соли мочевой кислоты откладываются в суставах и различных тканях. Много мочевой кислоты определяется в моче и крови при усиленном распаде нуклеопротеидов (лейкозах, после после облучения рентгеновскими лучами, гемолитической желтухе, злокачественных новобразованиях, диабете, отравлениями свинцом, угарным газом и т.д.).

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

1.Причины метаболической урикемии — повышенная продукция мочевой

кислоты или снижение ее экскреции: энзимодефекты, нарушение канальцевой экскреции, ускоренный гемолиз, псориаз, серповидно-клеточная анемия.

2.Причины вторичной урикемии — недостаточность глюкозо-6-фосфатазы, наследственно обусловленная непереносимость фруктозы, заболевания, сопровождающиеся миелопролиферацией, болезни почек и дегидратация (почечная недостаточность, отравление свинцом, передозировка мочегонных, несахарный диабет).

3.Классическая подагра — обусловлена одновременно тремя факторами: увеличением синтеза мочевой кислоты, уменьшением содержания уратсвязывающего белка и замедленным выведением с мочой. Известны два генетических энзимодефекта, приводящих к урикемии и подагре: а) повышение активности фосфорибозилпирофосфатсинтетазы; б) частичный дефицит гипоксантингканин-фосфорибозилтрансферазы.

4.Синдром Леша-Нихана — признаки подагры у мальчиков в возрасте от полугода до 16 лет.

На первый план выступают тяжелые неврологические симптомы. Основной патогенетический фактор — дефект гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы, катализирующей превращения гипоксантина и гуанина в инозинмонофосфат и ГМФ.

Рассмотрим эти патологии подробнее

95.83.17.156 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

По материалам studopedia.ru

Существующие методы определения концентрации мочевой кислоты можно разделить на несколько групп:

1. Колориметрические — все эти методы недостаточно специфичны и основаны на:

  • способности мочевой кислоты восстанавливать фосфорновольфрамовую и мышьяковомолибденовую кислоты, железосинеродистый калий;
  • прямом фотометрическом определении концентрации мочевой кислоты по реакции Фолина‑Дениса;
  • исследовании содержания по фенолгипохлоритной реакции.

2. Энзиматические — определение концентрации мочевой кислоты по расщеплению ее уриказой до аллантоина, СО2 и Н2О2. Результаты реакции учитываются:

  • по количеству потребленного кислорода;
  • регистрацией величины снижения абсорбции мочевой кислоты при 293 нм;
  • определением образовавшейся перекиси водорода. Последняя при участии каталазы окисляет метанол до формальдегида, определяемого дополнительной реакцией;
  • по флуоресценции образовавшихся продуктов после добавления флюорофора;
  • с помощью потенциометрического электрода с иммобилизованной уриказой;
  • образовавшаяся перекись водорода в присутствии каталазы вступает в реакцию с этанолом, образуется ацетальдегид, который восстанавливается НАДН, что сопровождается уменьшением светопоглощения при 340 нм.

Унифицированным методом является фосфорновольфрамовый метод.

Мочевая кислота восстанавливает фосфорновольфрамовый реактив с образованием комплекса голубого цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию в пробе мочевой кислоты.

Пища, богатая пуринами; диуретики, салицилаты, кортикостероиды, лекарственные вещества — производные пурина, фенола, гемолиз.

Определение концентрации мочевой кислоты имеет особое значение для диагностики начальных стадий поражения почек и подагры.

В крови выделяют два типа повышения содержания мочевой кислоты (гиперурикемии): первичную и вторичную .

Первичная гиперурикемия отмечается в связи с подагрой, связанной с увеличением эндогенного синтеза мочевой кислоты в результате нарушения обмена нуклеопротеидов, снижением содержания в плазме уратсвязывающего белка и замедлением выведения уратов с мочой. Также выявляется при синдроме Леша‑Нихана, при котором метаболиты распада пуринов превращаются в мочевую кислоту, а не используются повторно для синтеза нуклеотидов.

Вторичная гиперурикемия сопровождает почечную недостаточность, выявляется при поликистозе почек, гематологических заболеваниях, при злокачественных заболеваниях (лейкоз, лимфома, миеломная болезнь и другие диссеминированные опухолях), при сердечно‑сосудистых заболеваниях (гипертония, инфаркт миокарда, сердечная недостаточность), токсикозах беременности, синдроме Дауна, также встречается у больных эндокринными и обменными заболеваниями (диабет, гликогеноз I типа, гипо‑ и гиперпаратиреодизм, акромегалия, микседема), после применения лекарственных препаратов.

Гипоурикемия отмечается при лимфогранулематозе, миеломной болезни, гепатоцеребральной дистрофии (синдром Вильсона‑Коновалова), ксантинурии.

Увеличение содержания мочевой кислоты выявляется при подагре, лейкозах, вирусном гепатите, серповидноклеточной анемии, болезнь Вильсона‑Коновалова.

Снижение — при ксантурии, дефиците фолиевой кислоты, свинцовой интоксикации.

По материалам biokhimija.ru

Определение концентрации мочевой кислоты в биологических жидкостях ферментативным методом

Принцип метода: Мочевая кислота под действием фермента уриказы окисляется до алантоина с образованием перекиси водорода. Пероксид водорода реагирует с хромогеном (4-аминоантипирин с N-этил-N-(гидрокси-3-сульфопропил)-m-толуидином [TOOS]) с образованием сине-фиолетового красителя:

Интенсивность окраски раствора при длине волны 550 нм прямо пропорциональна концентрации мочевой кислоты в нем.

Линейность метода: 65,7 -1190 мкмоль/л.

Сыворотка крови – мужчины – 214-488 мкмоль/л (25-37С);

женщины – 137-363 мкмоль/л (25-37С).

Концентрация мочевой кислоты сохраняется стабильной в сыворотке/ плазме в течение 3 дней при комнатной температуре, при температуре хранения 2-8С – в течение 7 дней, при температуре –20С – в течение 6 месяцев.

Стабильность концентрации мочевой кислоты в моче – 4 дня при комнатной температуре.

Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 550 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 25-37С;

Автоматические пипетки на 20 мкл, 250 мкл и 1000 мкл;

Сыворотка крови/ гепаринизированная или ЭДТА- плазма / моча. Мочу предварительно развести дистиллированной водой в соотношении 1:10;

Реагент 1 (ТООS 1 ммоль/л в фосфатном буфере, рН 7,0 100 ммоль/л);

Реагент 2 (уриказа  50 Е/л, пероксидаза  1000 Е/л, 4-аминоантипирин 0,3 ммоль/л в фосфатном буфере, рН 7,0 100 ммоль/л);

Стандарт (раствор мочевой кислоты 357 мкмоль/л);

1. Образец (например, сыворотка)

Перемешать содержимое пробирок, инкубировать 5 мин

Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре или 5 мин при температуре 37С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 550 нм (оптическая плотность А). Окраска стабильна в течение 30 минут.

Расчет по стандарту концентрации мочевой кислоты в биологической жидкости проводят по формуле:

где Аоп / ст – изменение опт.плотн. в минуту;

Сст – концентрация стандарта (мкмоль/л).

Расчет по стандарту концентрации мочевой кислоты в моче проводят по формуле:

где Аоп / ст – изменение опт.плотн. в минуту;

Сст – концентрация стандарта (мкмоль/л);

11 – коэффициент разведения.

Если концентрация мочевой кислоты превышает 1190 мкмоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Клинико-диагностическое значение: Мочевая кислота и ее соли являются конечными продуктами пуринового обмена.

При подагре, наиболее общем осложнении гиперурикемии, повышенный уровень мочевой кислоты в сыворотке крови ведет к образованию вокруг суставов кристаллов моноуреата натрия. Гиперурикемия наблюдается также при заболеваниях почек с пониженной экскрецией отходов жизнедеятельности, при голодании, употреблении наркотиков, избыточном потреблении алкоголя, а также при приеме некоторых лекарств. Гиперурикемия – составная часть непрямого фактора риска коронарной болезни сердца.

Гипоурикемия наблюдается редко и связана с редкими наследственными нарушениями метаболизма.

По материалам studfiles.net

Принцип метода: метод основан на колориметрировании окрашенных продуктов, образующихся при восстановлении фосфорновольфрамового реактива мочевой кислотой.

Для определения в моче этап осаждения белка опускается.

Ход работы: в центрифужную пробирку налить 1,5 мл сыворотки крови,

добавить 1,5 мл 10% ТХУ + 1,5 мл воды. Через 10 минут смесь центрифугировать в течение 10 минут при 4000 об/мин. Затем в пробирку с отметкой 10 мл налить 1,5 мл центрифугата +0,7 мл насыщенного раствора соды

и добавляют 0,05 мл реактива Фолина. Довести объем жидкости до отметки дист. водой, перемешать и колориметрировать против воды с красным светофильтром. Содержание мочевой кислоты определяют по калибровочному графику.

Определение содержания мочевой кислоты в моче: 1,5 мл мочи + 0,7

мл соды + 0,05 мл реактива Фолина. Довести объем до 10 мл дист. водой.

Перемешать, колориметрировать на ФЭКе с красным светофильтром. Содержание мочевой кислоты определяют по калибровочному графику.

В моче мочевой кислоты в норме экскретируется 2 — 7 ммоль/сут

Норма содержания мочевой кислоты у взрослых – 0,15-0,47 ммоль/л, у детей — 0,6 ммоль/л.

Клиническое значение определения мочевой кислоты:

определение уровня этого метаболита (конечного продукта распада пуринов у человека) характеризует состояние пуринового обмена и интенсивность распада нуклеиновых кислот. Для правильной оценки этих показателей с целью исключения влияния пуринов алиментарного происхождения пациент должен в течение недели находиться на диете, обедненной содержанием нуклеопротеидов (исключить мясо, рыбу). Имеет значение обнаружение повышенных уровней мочевой кислоты в крови и моче.

Гиперурикемия почечного происхождения: наблюдается при поражении клубочков почки (острый и хронический нефрит, сморщенная почка). Причина — нарушается выделение мочевой кислоты с мочой. Гиперурикемия непочечного происхождения: наблюдается при подагре (связано с нарушением обмена нуклеотидов). Причина — соли мочевой кислоты откладываются в суставах и различных тканях. Много мочевой кислоты определяется в моче и крови при усиленном распаде нуклеопротеидов (лейкозах, после после облучения рентгеновскими лучами, гемолитической желтухе, злокачественных новобразованиях,

диабете, отравлениями свинцом, угарным газом и т.д.).

Решите следующие ситуационные задачи

1. При исследовании крови больного обнаружено 0,6 ммоль/л мочевой кислоты. Сколько мочевой кислоты содержится в крови здоровых людей? Могут ли данные анализа свидетельствовать о конкретной патологии?

2.У больного с мочой за сутки выделяется 1,5 г мочевой кислоты (норма 0,6 г), повышено ее содержание и в крови, (гиперурикемия). Врач назначил лечебный препарат аллопуринол, рекомендовал ограничить мясную пищу. Какую болезнь Вы диагностируете? Принцип действия аллопуринола?

3. При многократных анализах мочи у больного обнаруживаются значительное выделение уратов. Объясните причину уратурии? Какую диету следует рекомендовать больному?

4. Мягкий гидролиз нуклеиновых кислот, проведенный в лаборатории, показал, что они распадаются на следующие продукты: азотистое основание, соединенное с рибозой, а также рибозу, соединенную с фосфорной кислотой. Исходя из этого, установите строение нуклеотида. Напишите формулу АМФ и обоснуйте правильность такого изображения мононуклеотида.

5. В результате гидролиза неизвестного протеида в смеси обнаружено наличие протеида щелочного характера, пентоз, фосфорной кислоты и циклических азотистых соединений с 6- и 9-членными кольцами. Какой протеид был подвержен гидролизу? Дайте характеристику каждого соединения.

6. К раствору нуклеиновых кислот была прилита смесь разных белков:

альбуминов, глобулинов, глютелинов, проламинов, протаминов, гистонов.

При связи с каким белком нуклеиновые кислоты образуют нуклеопротеид?

7. Дана смесь органических соединений, одна из групп которых имеет циклическую структуру, способна к кето-енольной таутомерии, поглощает свет в УФ-области, является слабым, но высокоэффективным основанием. Что это за группа соединений? Почему для них характерны указанные свойства?

8. Могут ли амино-окси и метилпиримидины входить в состав ДНК и РНК в качестве азотистых оснований? Как особенности структуры этих соединений влияют на их биологические функции?

9. Каковы различия нуклеозидов и нуклеотидов по структуре и биологическим функциям? Как изменяется функция нуклеотида при его циклизации? (на примере ц-АМФ).

10.Каковы пути образования ди-, три-, и полинуклеотидов? Опишите эту возможность путем образования новых связей 3-5. Дайте характеристику этой группе веществ.

11. Какими химическими связями обусловлены первичная, вторичная и третичная структуры нуклеиновых кислот?

12. Больной Н. — 30 лет, жалуется на припухлость и боли в суставах, особенно мелких, в частности в суставах больших пальцев ног. В последнее время заметил появление мелких узелков вокруг суставов. Предположительный диагноз — ревматоидный артрит. Однако, специфическое лечение, в частности, гормонотерапия, положительного эффекта не оказала. Вместе с тем после приема алопуринола наступило значительное облегчение. Что это за заболевание? Какими мерами еще можно облегчить страдания больного?

13. В детскую клинику обратилась мама больного ребенка в возрасте трех лет. Диагноз не выставлен. У ребенка спастические параличи, нарушение мышления, в последнее время появилась агрессивность и склонность к самокалеченью. Лабораторно: содержание мочевой кислоты в моче 3,6 ммоль/сут, отношение концентрации мочевая кислота/креатинин выше нормы в 3 раза. Какое заболевание вы могли бы заподозрить у данного ребенка. Определение активности какого фермента в крови ребенка необходимо для подтверждения вашего диагноза

14. Из истории болезни: ребенок, 2 года, родился нормальным, однако в течение первого года развилась мегалобластическая анемия, резистентная к терапии железом, витамином В12 и фолиевой кислотой. Отстает в росте и умственном развитии от своих сверстников. Каким заболеванием страдает ребенок? В чем причина заболевания? Какую коррекцию состояния вы могли бы предложить?

По материалам lektsii.org

Понравилась статья? Поделить с друзьями: