Бактериологический метод выявления микобактерий туберкулеза

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

СОВРЕМЕННАЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА

УДК 616.24-002.5-078 (075.8) ББК 55.4 я73 С 56

Авторы: канд. мед. наук, асе. Г.С. Авдеев; ст. науч. сотр. НИИ пульмонологии и фтизиатрии О.М. Залуцкая; канд. мед. наук, доц. П.С. Кривонос; д-р мед. наук, рук. отдела иммуноморфологических исследований Л.К. Суркова; канд. мед. наук, асе. В.В. Пылишев

Рецензент д-р мед. наук, доц. каф. фтизиопульмонологии Белорусской ме­дицинской академии последипломного образования А.Н. Лаптев

Утверждено Научно-методическим советом университета в качестве методических рекомендаций 28.05.2003 г., протоколе» 7

Современная бактериологическая диагностика туберкулеза: Метод, рекомен-С 56 дации / Г.С. Авдеев, О.М. Залуцкая, П.С. Кривонос и др. — Мн.: БГМУ, 2003. — 22 с.

Рассматриваются современные методы бактериологической диагностики туберкулеза. В частно­сти подробно излагаются методики забора материала для исследования, бактериоскопическое исследо­вание, люминисцентная микроскопия, культуральное исследование, биологические методы и основные молекулярно-генетические методы диагностики туберкулеза.

Предназначаются для студентов 4-6 курсов медицинского факультета иностранных учащихся, лечебного, педиатрического, медико-профилактического факультетов, для клинических ординаторов, стажеров и врачей-фтизиатров.

УДК 616.24-002.5-078 (075.8) ББК 55.4 я73

© Белорусский государственный медицинский университет, 2003

9. Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний.

Контрольные вопросы по теме занятия:

Возбудитель туберкулеза: история открытия, основные свойства, так­сономическое положение.

Правила сбора мокроты для исследования на туберкулез.

Бактериоскопическое исследование мокроты с окраской мазка по Цилю-Нильсену: методика, интерпретация результатов.

Культуральное исследование на туберкулез: методика, интерпретация результатов.

Основные методы определения лекарственной устойчивости микобак­терии.

Автоматические системы для детекции микобактерии и определения лекарственной устойчивости.

Биологические методы диагностики туберкулеза.

Амплификационные методы, используемые для детекции микобакте­рии. ПЦР.

Генотипирование микобактерии туберкулеза.

УЧЕБНЫЙ МАТЕРИАЛ Возбудитель туберкулеза

Род Mycobacterium — единственный представитель группы 21 «Микобак­терии». Согласно девятому изданию «Определителя бактерий Берджи» этот род объединяет свыше 100 видов микобактерии; в клиническом диагностическом материале обычно определяется 10-12 видов микобактерии, 6 из которых пато­генны для человека. Это М. tuberculosis, M. bovis, M. qfricanum, M. avium, М. хепор и М. fortuitum. Хотя клеточная стенка микобактерии сходна с клеточ­ной стенкой грамположительных бактерий и представляет собой многослойный пептидогликановый комплекс, с ней связаны преимущественно липиды (мико-ловые кислоты, воски, фосфолипиды и ацетилированные трегалозы), а не белки и полисахариды, как у других бактерий. Это придает клеточной стенке мико­бактерии сильные гидрофобные свойства. В дополнение к липидам, которые могут составлять до 60% клеточной стенки, клетки микобактерии содержат уг­леводы и растворимые белки. Клеточная стенка микобактерии создает гидро­фобный барьер, затрудняющий проникновение в клетку водорастворимых со­единений. Вследствие этого микобактерии демонстрируют весьма медленную скорость роста и являются естественно устойчивыми к химическим воздействи­ям, в том числе к кислотам, спиртам и к большинству используемых в настоящее время антибиотиков. Поэтому выбор препаратов для лечения больных туберку­лезом и другими заболеваниями, вызываемыми микобактериями, ограничен.

Клетки микобактерии прямые или слегка изогнутые, имеют размеры 0,2-0,7 х 1,0-10 мкм. Микобактерии не образуют спор, жгутиков, мицелия и

капсул, одцако имеют микрокапсулу, отделенную от клеточной стенки осмие-фобной зоной. Типовой вид рода MycobacteriumМ. tuberculosis (МБТ). Ми­кобактерии характеризуются плеоморфизмом: клетки в молодых культурах имеют палочковидную форму, в старых — чаще кокковидную. Микобактерии иногда образуют L-формы, сохраняющие инфекционностьг а также фильтрую­щиеся формы (их патогенетическая роль изучена недостаточно). Вирулентные штаммы М. tuberculosis обладают так называемым*корд-фактором (трегалоза-6,6′-димиколат), обусловливающим слипание бактериальных клеток в микро­колониях. Микобактерии являются аэробами, но способны расти в факульта­тивно анаэробных условиях; концентрация С02 5-10% способствует более бы­строму росту. Размножаются делением, время генерации составляет 14-18 ча­сов (для сравнения у E.coli — 20 минут). У микобактерии направления репликативной вилки и транскрипции совпадают только у 56% генов (для сравнения, у Bacillus subtilis этот показатель составляет 78%), что является еще одной причиной медленного роста. Для роста in vitro микобактерии нуждаются в белковом субстрате и глицерине, а также в углероде, хлоре, сере, фосфоре, азоте, факторах роста (биотине, никотиновой кислоте, рибофлавине и др.), в ионах (Mg 2+ , K + , Na + , Fe 2+ ). Температурный оптимум составляет 37-3 8°С, опти­мум рН 7,0-7,2.

Диагностический материал для исследования на туберкулез

При исследовании с целью выявления МБТ можно использовать любой патологический материал: мокроту, которую выделяет больной, или получен­ную после раздражающей ингаляции; бронхиальный секрет; бронхоальвеоляр-‘ный смыв (БАС); материал катетер- и аспирационной биопсии, полученный при бронхоскопии; аспираты из трахеи; экссудат; транссудат из плевральной и брюшной полостей; гной из натечников и свищей; мочу; спинномозговую жид­кость; содержимое открытых ран; менструальную кровь; соскобы эндометрия; сперму; секрет предстательной железы; пунктаты яичек; биопсийный, аутоп-сийный материал; органы экспериментальных животных; смывы с предметов больничной среды и др. Использование бронхоскопии для взятия микробиоло­гических образцов оправдано только при многократных неудачных попытках получения материала более простыми способами у больных с неясным диагно­зом. В ряде случаев, когда больному трудно откашлять мокроту, прибегают к специальным методам, например, стимуляции выделения мокроты. Мокрота, собранная после стимуляции, по внешнему виду напоминает слюну, поэтому такой материал перед направлением в лабораторию снабжают специальной маркировкой («индуцированная мокрота»).

Все клинические образцы, предназначенные для бактериологического ис­следования, должны быть собраны до или в течение первых нескольких дней химиотерапии, поскольку в некоторых случаях нескольких дней специфиче­ской терапии достаточно для того, чтобы прекратить бактериовыделение, и то­гда бактериологическое исследование бесполезно.

Эффективность микробиологической диагностики туберкулеза в значи­тельной степени зависит от правильности сбора диагностического материала. От соблюдения правил сбора, хранения и транспортировки диагностического материала зависит также эпидемиологическая безопасность окружающих.

Мокроту (основной диагностический материал для исследования на ту­беркулез) собирают в специальные стеклянные баночки емкостью около 50 мл с герметически закрывающимися крышками. Необходимо использовать баночки с широким горлышком (диаметр не менее 35 мм), чтобы пациент мог легко со­брать мокроту без контаминации наружной поверхности баночки. Мокроту можно собирать также в одноразовые плевательницы, которые после использо­вания подлежат уничтожению. Посуда для сбора мокроты должна быть сделана из прозрачного материала, чтобы можно было определить количество и состоя­ние собранного материала, не снимая крышку с баночки.

Мокрота для исследования должна собираться под контролем медицин­ского персонала с обязательным проведением инструктажа о правилах сбора мокроты, которые сводятся к следующему:

Добейтесь взаимопонимания с больным и объясните ему, для чего не­обходимо провести исследование мокроты, как нужно откашливать мокроту из глубоких отделов легких. Объясните больному, что он не должен собирать слюну или носоглоточную слизь.

Проинструктируйте больного, чтобы он прополоскал рот перед сдачей мокроты. При этом из полости рта удаляются остатки пищи и контаминирую-щие бактерии.

Пациент должен сделать два глубоких вдоха и задержать дыхание на несколько секунд после каждого из них, а затем медленно выдохнуть. Затем вдохнуть в третий раз и с силой выдохнуть воздух. Потом вдохнуть еще раз и затем покашлять. Это способствует получению мокроты из глубоких отделов легких.

После появления продуктивного кашля пациент должен поднести к губам контейнер и аккуратно сплюнуть в него мокроту. Нередко мокрота быва­ет густой и слизистой, хотя может быть и жидкой, с частицами некротических тканей из пораженных участков легких. Цвет мокроты может быть грязно-белым или грязновато-светло-зеленым. Мокрота с примесью крови имеет крас­ный или коричневый цвет.

Жидкая прозрачная слюна или выделения из носоглотки не являются мокротой и имеют небольшую ценность при диагностике туберкулеза.

Для исследования необходимо получить достаточное количество мок­роты (3-5 мл), содержащей плотные гнойные частицы, а не слюну.

Во время продуктивного кашля пациента образуется аэрозоль, содержа-щий МБТ. В целях обеспечения мер безопасности при откашливании мокроты пациентом и предупреждения инфицирования медицинского персонала потен­циально заразными аэрозолями сбор мокроты должен осуществляться в специ­ально оборудованном помещении, оснащенном бактерицидными лампами, ло­кальной вытяжной вентиляцией, в присутствии медицинского персонала с обя­зательным проведением инструктажа о правилах сбора мокроты. Если условия

этого не позволяют, то сбор мокроты проводят вне помещения (на открытом воздухе) или в помещении, где нет других людей, под контролем медицинского работника. В любом случае нельзя собирать мокроту в замкнутых помещениях. Образцы мокроты от одного пациента не объединяют в одном сосуде, а направ­ляют в лабораторию с указанием сведений о пациенте для каждой пробы. Дос­тавку мокроты в лабораторию осуществляют сразу после взятия в плотно за­крытом промаркированном контейнере, помещенном в бикс для транспорти­ровки. Если транспортировка откладывается, собранную мокроту следует хра­нить в холодильнике при 4°С не более одних суток или в консерванте не более трех суток.

Методы бактериологической диагностики туберкулеза

Бактериологическая лаборатория играет существенную роль в выявлении, диагностике туберкулеза, выборе рациональных схем химиотерапии и оценке их эффективности. Бактериологическая диагностика включает обработку кли­нического материала, микроскопическое исследование, выделение микроорга­низма с применением культуральных методов, идентификацию микобактерий с использованием бактериологических и биохимических тестов, а также опреде­ление лекарственной чувствительности микобактерий.

Существует несколько групп методов, используемых для выявления МБТ в различном диагностическом материале: рутинные (микроскопия, культураль-ное исследование), биологические (биопроба, определение вирулентности штаммов МБТ), автоматические системы (MGIT, BACTEC, MB/BacT, ESP Cul­ture System и др.), молекулярно-генетические методики (PCR, LCR, NASBA, QBeta и др.). Каждый из этих методов обладает определенной чувствительно­стью и специфичностью, что необходимо учитывать при клинической интер­претации полученных результатов.

Таблица 1 Чувствительность различных методов бактериологической диагностики туберкулеза

источник

Большое значение в правильности выполнения лабораторных поисков МБТ имеет забор патологического материала.Посуда, в которую собирают патологический материал,должна быть стерильной. Наиболее часто исследуется мокрота. Собранные образцы должны быть немедленно отосланы в соответствующую лабораторию. Если такой возможности нет, материал сохраняют в холодильнике при температуре воздуха 4-10 о С. Если лаборатория расположена в отдалении от учреждения здравоохранения, доставку материала для исследований осуществляют 1 или 2 раза в неделю. Для этого должны использоваться специальные контейнеры. Контейнеры должны быть прочными, устойчивыми к разрушению, иметь широкую горловину с герметически завинчивающейся пробкой, чтобы предотвратить случайное вытекание из нее содержимого.

При сборе образцов риск инфекции очень большой, особенно когда больной выкашливает мокроту, в связи с этим процедуру необходимо проводить как можно дальше от посторонних лиц и в специальном помещении/кабине.

Мокроту на МБТ в амбулаторных условиях собирают трижды, после соответствующего туалета полости рта:

1. Первая проба – в поликлинике или стационаре, в присутствии медицинского работника, через 1-2 часа после сна.

2. Вторая проба – в тот же день через несколько часов (3-4 часа).

3. Третья проба – на следующий день пациент приносит мокроту сам.

У нетранспортабельных пациентов забор мокроты производит участковая медсестра поликлиники на дому в стерильную посуду и доставляет в бактериологическую лабораторию.

Методы этиологической диагностики туберкулеза

– с окраской по Циль-Нельсену;

– посевы на плотные питательные среды (Левен-

– посевы на жидкие питательные среды с автома-

тизированным учетом роста типа BACTEC MGIT 960/320 TB

Биочиповая, стриповая, картриджная технологии,

ПЦР в режиме реального времени

Рис. 2. Алгоритм этиологической диагностики туберкулеза

Цель этиологической диагностики туберкулеза:

• выявление эпидемиологически опасных больных туберкулезом – бактериовыделителей (с МБТ+);

• верификация диагноза туберкулеза;

• определение лечебной тактики;

• оценка эффективности лечения и прогноза;

• для эпидемического контроля за туберкулезом.

Бактериоскопический метод выявления МБТ наиболее простой, дешевый, специфический, доступный по сравнению со всеми другими методами диагностики туберкулеза. Бактериоскопический метод имеет свои разновидности: простая бактериоскопия иLEDили люминесцентной микроскопии (рис. 3).

При простой бактериоскопии мазок красят по Цилю-Нильсону: стеклянной палочкой гнойные комочки мокроты наносят равномерно на предметное стекло, и фиксируют в пламени горелки. Далее красят карболовым фуксином, который после нанесения подогревают в пламени, чтобы краситель лучше проник в МБТ, после промывания мазка обесцвечивают в 25 % растворе сернойкислоты или в 3 % соляно-кислом спирте. Обесцвеченные элементы мазка докрашивают 0,3 % раствором метиленового синего. Микобактерии не воспринимают обычные анилиновые красители, в результате чего кислотоустойчивые микобактерии окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микробы и клеточные элементы – в голубой цвет. МБТ под микроскопом имеют вид продолговатых палочек, розового цвета на синем фоне. На окрашивание затрачивается 20-30 минут. Метод простой и дешевый, но мало информативный, чтобы обнаружить МБТ в 1 см 3 мокроты должно быть около 50-100 тыс. МБТ, если же будет меньше, то МБТ не будут найдены.

В основу метода люминесцентной микроскопии включена окраска МБТ флюорохромами (аурамин, родамин и др.), которые также связываются с воскоподобными структурами микробной клетки и светятся в ультрафиолетовых лучах. LED (light emitted diode – светоизлучающие диоды) технологии позволяют конвертировать обычный световой микроскоп во флюоресцентный, увеличивая и улучшая технические возможности люминесцентной микроскопии.

При бактериологическом исследовании патологический материал культивируют на питательных средах, и выделяют культуру МБТ в чистом виде. Наиболее часто используют следующие питательные среды: Левенштейна-Йенсена, Финн-2. Перед посевом на питательные среды проводят обработку патологического материала для уничтожения сопутствующей флоры, разжижения, деконтаминации. В зависимости от материала, степени его гомогенности и загрязнённости для предпосевной обработки используют различные деконтаминанты. Для мокроты в основном используют 10 % раствор трёхзамещённого фосфорно-кислого натрия. После предварительной обработки материал центрифугируют, за счёт этого осаждают микобактерии, и повышают их содержание в осадке («обогащение осадка»). Полученный осадок подвергают нейтрализации, и засевают им (инокулируют) поверхность плотных питательных сред или пробирки с жидкими (полужидкими) средами. Из оставшейся части осадка готовят мазки для микроскопического исследования, так как микроскопическое и культуральное исследования нужно производить параллельно из одной и той же пробы диагностического материала (рис. 2). При использовании плотных сред инокулированные пробирки помещают в термостат при температуре 37 С на 2 суток в горизонтальном положении. Это обеспечивает более равномерное всасывание материала в питательную среду. Через 2 суток пробирки переводят в вертикальное положение, и герметично закрывают резиновыми или силиконовыми пробками во избежание подсыхания засеянных сред. Посевы выдерживают в термостате при 37 о С в течение 10-12 недель при регулярном еженедельном просмотре.

на среде Левенштейна-Йенсена

Рис. 3 Вид МБТ под микроскопом и в культуре

Длительность получения результатов исследований на основе классических метод выявления/культивирования микобактерий туберкулеза (в течение 1-3 месяцев) неблагоприятно сказывается на эффективности химиотерапии, особенно в связи с вероятностью неправильного выбора схемы химиотерапии при наличии ЛУ у возбудителя и риском расширения спектра устойчивости МБТ.

Культивирование на жидкой питательной среде в автоматизированной системе учета роста микроорганизмов – ускоренный культуральный диагностический метод (10- 14 дней)

Культивирование на жидкой среде повышает выявление МБТ примерно на 10% по сравнению с твердыми средами. В настоящее время широко используются системы с автоматической детекцией учета роста МБТ, которые позволяют значительно ускорить получение результат. В бактериологических лабораториях медицинских организаций фтизиатрического профиля РФ преобладающей является автоматизированная система BACTEC MGIT 960/320.

Рис. 3. Автоматизированная система культивирования микобактерий: MGIT-BACTEC-960

Преимущества автоматизированной системы культивирования BACTEC MGIT 960/320 перед культуральными исследованиями на плотных питательных средах обеспечиваются высокой эффективностью стандартизованных и сертифицированных по ISO9001 производств реагентов и сред, а также поддержанием стандартных протоколов исследований.

В основе методики лежит изобретение индикаторной пробирки MGIT (mycobacteria growth indicating tube). Содержимое пробирки MGIT – это питательный бульон, благодаря которому достигается более эффективное выделение микобактерий и их ускоренный рост. Пробирка содержит 7 мл стерильного питательного бульона Мидлбрук 7Н9, в которую перед использованием вносится обогатительная добавка для стимуляции роста МБТ. На дне пробирки содержится кислородзависимый флюорохромный краситель. Во время бактериального роста внутри пробирки происходит поглощение свободного кислорода и его замещение углекислым газом. По мере расходования свободного кислорода возникает флюоресценция. Флюоресценция становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор BACTEC MGIT 960/320 (рис. 4). Один раз в час флуоресцентный сенсор считывает результаты тестирования. Интенсивность свечения прямо пропорциональна уровню расходования кислорода и регистрируется в единицах роста (GU –growth units). В среднем появление роста МБТ сокращается до 11 дней. Прибор оценивает пробу как отрицательную при отсутствии роста в течение шести недель (42 дня).

Результат

незначительное или полное отсутствие свечения

Результат

на дне пробирки и оранжевое отражение в колене пробирки

Рис. 4. Результаты индикаторной пробирки MGIT на выделения культуры МБТ

Основное преимущество исследований на основе молекулярно-генетических методов в том, что они являются «быстрыми» методами, позволяющими получить результаты в относительно короткий временной период. Заключение о наличии МБТ в диагностическом материале делается на основании выявления видоспецифичного генетического маркера (ДНК) МБТ или видоспецифичных белков-антигенов, а вывод о ЛУ — на основании выявления мутаций в целевых участках генов МБТ, ассоциированных с ЛУ.

Из всех молекулярно-генетических подходов базовым методом, применяемым для выявления M.tuberculosis complex является полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Проведение ПЦР-анализа происходит в три этапа:

Детекция ДНК-продуктов амплификации

Выделение ДНК — это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции (табл. 3).

Варианты проведения амплификации и визуализации результатов ПЦР

Визуализации результатов ПЦР

ПЦР с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации

ПЦР с последующей гибридизацией продуктов амплификации на стрипах

ПЦР с последующей гибридизацией продуктов амплификации на биологических микрочипах

ПЦР с определением специфического продукта по значению флуоресценции специфического зонда в конечной точке

ПЦР в режиме реального времени (получение результатов непосредственно во время прохождения реакции)

Выделение ДНК из диагностического материала, полученного от больных туберкулезом – сложный многоэтапный процесс, который может производится вручную или с использованием автоматов для выделения.

Амплификация ДНК. Для осуществления амплификации ДНК используются так называемые ДНК-матрицы — молекулы ДНК МБТ, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК. Для проведения этого этапа достаточно небольшого кусочка молекулы ДНК, который присущ только МБТ. В большинстве тест-систем избран фрагмент ДНК IS6110, который в многочисленных штаммах МБТ имеет в геноме значительное число (10-20) повторов, что обеспечивает, наряду со специфичностью, высокую чувствительность анализа.

Все многочисленно повторяющиеся этапы амплификации происходят при различных температурах. Для проведения ПЦР-анализа используется специально программируемое оборудование – ПЦР–термостат или амплификатор, которое автоматически осуществляет смену температур. Амплификация проводится по заданной программе и составляет 2 часа.

В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК способностью флюоресцировать — отражаться оранжево-красными светящимися полосами. Образующееся свечение выдает присутствие ДНК МБТв забранном у пациента на ПЦР-анализ материале.

Одной из инновационных технологий, основанных на ПЦРв режиме реального времени, является использование анализатора Xpert MTB/RIF (Cepheid, США). Этим оборудованием оснащены многие противотуберкулезные учреждения РФ. Она упрощает молекулярное тестирование, обеспечивая полную интеграцию и автоматизацию трех процессов (подготовка образца, амплификация и детекция), необходимых для молекулярного тестирования. Тест Xpert MTB/RIF имеет аналитическую чувствительность пяти геномных копий очищенных ДНКM. tuberculosis. Молекулярные маяки, которые нацелены на ген «rpoB», охватывают все мутации, обнаруженные в >99,5 % штаммов, устойчивых к рифампицину. Перекрестная реактивность с нетуберкулезными микобактериями отсутствует. ДНК МБТ, устойчивая к рифампицину выявляется в присутствии, как нетуберкулезных ДНК, так и в смешанных чувствительных и устойчивых штаммах. Образцы материала человека в основном могут быть взяты из мокроты, промывных вод бронхов, мочи, плеврального экссудата, ликвора. Итоговые результаты тестов предоставляются в графическом и табличном форматах (рис. 5). Xpert MTB/RIF позволяет сразу при подозрении у пациента туберкулеза взять у него мокроту и в течение двух часов определить есть ли у него МБТ и устойчивые ли они к самому эффективному противотуберкулезному препарату (рифампицин). Данная методика позволяет с первых дней назначить адекватную химиотерапию, и распределить потки поступающих больных в противотуберкулезный диспансер и направить в специализированные отделения (с лекарственно-устойчивым туберкулезом).

Рис. 5 Анализатора Xpert MTB/RIF . Подготовка образцов к проведению теста

При работе системы GeneXpert необходимы минимальное число ручных операций и специализированных знаний. Пользователь просто добавляет биологический образец для тестирования в картридж, ставит его на борт прибора, и система GeneXpert автоматически запускает цикл реакций (рис. 5). Прибор GeneXpert компактен и удобен, может быть установлен вне лаборатории. Малые размеры прибора и незначительные потребности в энергии позволяют системе работать практически в любом помещении. Настольный ПК или ноутбук используется для выполнения программного обеспечения и хранения базы данных, содержащей результаты работы системы GeneXpert. Программное обеспечение позволяет выбирать описания тестов, контролировать процесс тестирования, просматривать результаты теста и экспортировать данные для анализа в приложениях сторонних разработчиков. Программное обеспечение также используется для архивирования результатов, извлечения данных из архива и управления базой данных. Сканер штрих-кодов ускоряет ввод данных, а также снижает вероятность возникновения ошибки при вводе данных.

Дифференциация (типирование) микобактерий туберкулеза

Необходимо отличать микобактерии туберкулеза от сапрофитных микобактерий, которые определяются в 0,3-3% культур.

Кислотоустойчивые сапрофитные микобактерии можно выделить как из внешней среды, так и из материала здорового человека, а также и из патологического материала. Присутствие сапрофитных микобактерий в мокроте, слюне, промывных водах желудка и бронхов, моче, кале и т. д. может быть не связано с наличием заболевания и служить источником серьезных диагностических ошибок. Обнаружение кислотоустойчивых сапрофитов в мокроте больных может привести к ошибочному диагнозу туберкулеза.

Идентификация микобактерий по культуральным свойствам.При посеве на плотные питательные среды на основании скорости роста бактерий, морфологии и окраски колоний (пигментообразование) можно сделать предварительное заключение о принадлежности культуры либо к комплексу МБТ, либо к нетуберкулезных микобактерий (НТМБ). При культивировании МБТ на жидких питательных средах проводится тестирование на контаминацию (микроскопия культуры с окраской по Цилю-Нильсену и посев на кровяной агар) и затем молекулярно-генетическими методами подтверждается принадлежность к микобактериям туберкулезного комплекса;

Идентификация микобактерий с помощью биохимических тестов

Дифференциация микобактерий туберкулезного комплекса и нетуберкулезными видами микобактерий основана на их культуральных свойствах и способности к росту на дифференциально-диагностических средах. Наиболее часто применяемыми и общепринятыми тестами являются способность к росту на среде, содержащей 1000 мкг/мл натрия салициловокислого; к росту на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; к росту на среде, содержащей 5% хлорида натрия. Виды микобактерий туберкулезного комплекса не способны к росту на указанных питательных средах. Для дифференциации вида M.bovisот других видов туберкулезных микобактерий используют культуральный тест на способность к росту на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2 карбоксиловой кислоты. Среди всех представителей этой группы только указанный вид не дает роста на этой питательной среде.

Для контроля контаминации при культивировании на жидкой/плотной питательной среде проводят посев культур на чашки Петри с кровяным агаром. Наличие роста микроорганизмов через 24-72 часа инкубации при +37°С свидетельствует о контаминации материала посторонней микрофлорой.

Эти исследования являются достаточно длительными, трудоемкими и требуют дополнительных капиталовложений, материально-технической базы, надлежащих условий, обеспечивающих биологическую безопасность.

Идентификация микобактерий с помощью молекулярно-биологических методов

Методы видовой идентификации, основанные на выявлении генетических маркеров МБТ с помощью ПЦР, имеют преимущество в специфичности и быстроте анализа по сравнению с культуральными и биохимическими методами.

Молекулярные методы дифференциации МБТ от нетуберкулезных микобактерий основаны на выявлении видоспецифических структур в геноме или белковом спектре возбудителя. Одни методы направлены только на дифференцировку микобактерий туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий, другие — пригодны для точной видовой идентификации возбудителя.

К методам, дифференцирующим микобактерий туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий, относится ПЦР, выявляющая вставочную последовательность ДНКIS6110, присутствующую только у микобактерий туберкулезного комплекса.

Иммунохроматографический методидентификации выросших культур микроорганизмов (метод поддержан ВОЗ), основанный на определении наличияспецифического антигена МБТ МРТ64, отличается простотой выполнения и позволяет получить результат идентификации МБТ за 15 минут. Данный метод может быть рекомендован в качестве основного при проведении идентификации культур, выросших на жидких и/или плотных питательных средах, а также в контаминированных культуральных образцах.

Методики, обеспечивающие точную видовую идентификацию нетуберкулезных микобактрий, более трудоемки и требуют больших материальных затрат. К ним относится гибридизационные технологии на нейлоновых мембранах (ДНК-стрипы), позволяющие идентифицировать следующие виды нетуберкулезных микобактерий: M.avium ssp., M.chelonae, M.abscessus, M.fortuitum, M.gordonae, M.intracellular e, M.scrofulaceum, M.interjection, M.kansasii, M.malmoense, M.peregrinum, M.marinum, M.ulcerans, M.xenopi и M.simiae, M.mucogenicum, M.goodii, M.celatum, M.smegmatis, M.genavense, M.lentiflavum, M.heckeshornense, M.szulgai, M.intermedium, M.phlei, M.haemophilum, M.kansasii, M.ulcerans, M.gastri, M.asiaticumvL M.shimoidei. Этим методом можно исследовать культуры с плотной и жидкой питательных сред и получить результат в течение 1 -2 дней.

Идентификация МБ до вида может проводиться также с помощью секвенирования, MALDI-ToF масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), тонкослойной хроматографии, результаты которых основаны на выявлении уникальных для каждого видаМБ структур.

Определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП

Цель микробиологических методов исследования лекарственной чувствительности МБТ к ПТП состоит в том, чтобы определить отличается ли клинический изолят от «дикого» штамма МБТ по степени чувствительности к соответствующему антимикробному агенту. При оценке результата микробиологического исследования культура МБТ признаётся устойчивой, если микобактерии дают рост на питательной среде в присутствии критической концентрации заключённого в неё противотуберкулёзного препарата.

Методы определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП

Метод абсолютных концентраций на плотной

среде Левенштейна-Йенсена. Регистрация МБТ:

– по нитратредуктазной активности МБТ.

Метод пропорций на жидких питательных средах

с автоматизированным учетом роста типа

ПЦР в режиме реального времени,

бБиочиповая, стриповая, картриджная технологии

Метод абсолютных концентраций на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена, основанный на добавлении в культуральную среду определенных стандартных концентраций противотуберкулезных препаратов, которые принято называть критическими при расчете на мкг/мл. Критическая концентрация – это самая низкая концентрация, которая подавляет рост 95% «диких» штаммов МБТ. Для каждой среды или системы культивирования подобраны соответствующие критические концентрации препаратов. Культура МБТ считается чувствительной к той или иной концентрации противотуберкулезного препарата, которая содержится в среде, если число колоний МБТ, выросших в одной пробирке с тем или иным ПТП, не превышает 20, а посевная доза соответствует 10 7 микробных тел.

Модифицированный метод пропорций в жидкой питательной среде в системе с автоматизированным учетом роста микроорганизмов типа BACTEC MGIT 960. В процессе определения происходит сравнение скорости роста МБТ — в контрольной пробирке и в пробирках с лекарственными препаратами. В первую пробирку не вносится лекарственный препарат — контрольную, в остальные пробирки добавляются известные концентрации тестируемых лекарственных препаратов, рост в которых сравнивается с ростом в контрольной пробирке.

Если тестируемый лекарственный препарат активен по отношению к выделенным МБТ, он будет ингибировать рост и подавлять флюоресценцию, при этом в контрольной пробирке рост не ингибируется и, соответственно, уровень флюоресцентности в данной пробирке будет выраженный. Мониторинг роста осуществляется при помощи прибора BACTEC MGIT 960/320, который автоматический интерпретирует результаты на наличие чувствительности или резистентности МБТ к препарату.

На плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена проводят определение ЛЧ МБТ методом абсолютных концентраций к ПТП первого ряда (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол) и к ПТП второго ряда (канамицин, капреомицин, циклосерин, офлоксацин, этионамид, аминосалициловая кислота, амикацин).

На жидких питательных средах проводят определение ЛЧ МБТ к ПТП первого ряда (изониазид, рифампицин, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид) и к ПТП второго ряда (амикацин, канамицин, офлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, этионамид, протионамид, капреомицин, аминосалициловая кислота, линезолид).

Молекулярно-генетические методы определения лекарственной чувствительности/устойчивости МБТ

Генотипические методы определения лекарственной чувствительности/устойчивости МБТ основаны на изучении специфических участков генома МБТ и выявлении наличия или отсутствия определенных мутаций в генах, связанных с резистентностью к конкретным ПТП. При этом исследованию могут подвергаться как диагностический материал, так и выросшие культуры микроорганизмов.

Основным достоинством молекулярно-генетических является быстрое и достоверное выявление больных МЛУ ТБ, так как они позволяют выявить ЛУ МБТ к рифампицину и изониазиду, а также к важнейшим препаратам второго ряда, позволяя использовать разделение потоков больных и включать в режим лечения наиболее эффективные препараты.

Молекулярно-генетические тест-системы определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза представлены тремя основными технологиями:

Гибридизационные технологии, основанные на гибридизации продуктов ПЦР со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизированными на матрице, которая может представлять собой биологический микрочип, или ДНК-стрип. Гибридизационные технологии позволяют в культуре с плотной или жидкой среды или непосредственно в мокроте, положительной по результатам микроскопического исследования, в течение 1-2 дней выявлять наиболее распространенные мутации в генах МБТ, связанных с устойчивостью к основным ПТП первого ряда — изониазиду и рифампицину и некоторым ПТП второго ряда (в зависимости от тест-системы). Данная группа методов основана на том, что амплифицированные в результате ПЦР целевые последовательности гибридизуются с зондами, нанесенными на соответствующую матрицу. По результатам гибридизации делается вывод о наличии мутаций, влекущих устойчивость к ПТП.

Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени. Метод ПЦР в режиме реального времени позволяет определять мутации, ассоциированные с ЛУ к рифампицину, изониазиду. Преимуществом данного метода перед описанными выше является отсутствие этапа гибридизации и оценка результатов в режиме реального времени, что позволяет снизить возможность кросс-контаминации образцов. Однако, для получения информации, сравнимой с гибридизационными технологиями, необходимо проведение большего числа циклов анализа. Использование зарегистрированных наборов позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью (94 % и 99 %, соответственно) выявлять мутации в генах rpoB, katG и inhA, ассоциирующиеся с устойчивостью к рифампицину и изониазиду.

«Картриджная» технология (выделение ДНК и амплификация идут автоматически в специальном картридже в системе GeneXpert).

Использование этой системы позволяет непосредственно из нативной мокроты в очень короткие сроки (в течение 2,5 часов) одновременно проводить выявление ДНК МБТ и с высокой достоверностью определять устойчивость к рифампицину.

Классификация лекарственной устойчивости МБТ

Первичная лекарственная резистентность – это устойчивость МБТ к ПТП, которая обнаружена у впервые выявленных больных, которые никогда не принимали противотуберкулезную терапию.

Вторичная лекарственная устойчивость (приобретенная) – резистентность МБТ, которая обнаружена у больных, которые принимали ПТП больше 4 недель. Лекарственная устойчивость классифицируется как:

Монорезистентность – устойчивость только к одному ПТП.

Полирезистентность – устойчивость к двум и ПТП, но не к сочетанию изониазида и рифампицина.

Устойчивость к рифампицину – лекарственная устойчивость МБТ к рифампицину независимо от лекарственной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам, определенная любым методом тестирования лекарственной чувствительности.

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) – устойчивость к сочетанию изониазида и рифампицина независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам.

Широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ) – сочетанная устойчивость к изониазиду, рифампицину, фторхинолону и канамицину и/или амикацину и/или капреомицину независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам.

Причины лекарственной устойчивости:

1) биологические – недостаточная концентрация препарата в очаге туберкулезной инфекции, индивидуальные особенности организма пациента (быстрая скорость инактивации препаратов);

2) причины, обусловленные пациентом – контакт с больными резистентным туберкулезом, отсутствие приверженности лечению (нерегулярный прием препаратов, неосознания важности лечения, преждевременное прекращение приема ПТП), неудовлетворительная переносимость препаратов, в том числе и сопутствующая патология, требующая приостановления (коррекция) противотуберкулезной терапии;

3) факторы, обусловленные течением заболевания – распространенный, быстропрогрессирующий деструктивный процесс;

4) факторы, обусловленные назначенным лечением – неадекватная схема лечения, лечение одним препаратом (монотерапия), недостаточная доза или длительность лечения, использования препаратов с перекрестной стойкостью, использование ПТП низкого качества, где доза препарата не соответствует заявленной.

источник

Выявление микобактерий туберкулеза (МБТ) в патологическом мате­риале (мокрота, моча, кал, ликвор, экссудат, биоптаты различных тканей и тд.) осуществляется бактериоскопическим, бактериологическим и биологи­ческим методами.

Бактериоскопический метод является основным для выявления МБТ. Препарат окрашивают по методу Циля-Нильсена (карболовый рас­твор фуксина, обесцвечивание спиртом, докраска метиленоиым синим). Окрашенные препараты микроскопируют с иммерсионной системой. МБТ, будучи кислотоустойчивыми, не обесцвечиваются спиртом и окрашиваются в красный цвет, окружающий фон и некислотоустойчивыо микроорганиз­мы — в синий цвет.

Разрешающая способность бактериоскопического метода увеличивает­ся за счет использования люминесцентной микроскопии при окрашивании препаратов специальными флюоресцирующими красителями — флюорохромами.

Для обнаружения МБТ необходимо, чтобы в 1 МЛ материала находи­лось не менее 100 ООО микроорганизмов. При меньшем их числе исследо­вание может дать ложноотрицательиый результат, Таким образом, чувстви­тельность данного метода существенно ограничена.

Для увеличения количества микобактерий в единице исследуемого объема применяют методы флотации и седиментации. Наибольшее рас­пространение получил метод флотации, основанный на том, что после встряхивания водной суспензии с углеводородом МБТ всплывают вместе с образующейся пеной на поверхность. В качестве углеводорода обычно используется бензин, бензол, ксилол. Образующееся на поверхности фло­тационное кольцо из частиц углеводорода с микобактериями служит мате­риалом для приготовления препаратов. Метод флотации повышает чувстви­тельность метода на 10-15%.

Бактериологический метод предполагает посев материала на питательные среды. Существуют различные среды для выращивания мико­бактерий. Наиболее дешевой, а потому самой распространенной, является среда Левенштейна-Йенсена. Основным ее недостатком являются дли­тельные сроки исследования: рост культуры МБТ продолжается 2-3 меся­ца. В настоящее время имеются среды, которые позволяют получить ре­зультат гораздо быстрее и поэтому более удобны для использования. Ши­роко в практике они не применяются из-за очень высокой стоимости.

Перед посевом материала его обрабатывают кислотой для уничтоже­ния сопутствующей неспецифической флоры.

Чувствительность бактериологического метода значительно выше: он позволяет выявить МБТ в количестве 20-100 на 1 мл. Преимуществом метода также является и то, что после получения чистой культуры можно определить вирулентность МБТ, чувствительность их к химиопрепаратам и др. Основной недостаток, как уже говорилось, — длительность исследова­ния. Кроме того, нередко определяемые при бактериоскопии микобактерии не растут на питательных средах, утратив способность к размножению под влиянием химиопрепаратов. В этом случае бактериологический метод даст ложноотрицательный результат. При отрицательном результате рекоменду­ются повторные исследования.

Биологический метод заключается в заражении морских свинок патологическим материалом от больного (чаще всего мокротой). Морские свинки очень чувствительны к МБТ, поэтому являются наиболее удобным объектом для исследования.

Перед заражением морской свинки мокроту обрабатывают серной ки­слотой с целью уничтожения сопутствующей неспецифической микрофло­ры и центрифугируют. Осадок, разведенный в изотоническом растворе хлорида натрия, вводят свинке подкожно в паховую область, внутрибрюшинно или в яичко. Для снижения резистентности животного к МБТ ему ежедневно вводят большие дозы глюкокортикоидов (кортизон).

Примерно через 1-3 месяца у морской свинки увеличиваются лимфа­тические узлы, затем развивается генерализованный туберкулез.

Недостатком метода является трудоемкость и длительность, преиму­ществом — высокая чувствительность. В то же время имеются микобакте­рии , утратившие вирулентность, которые не будут вызывать туберкулез у лабораторного животного (ложноотрицательный результат).

источник

МИКОБАКТЕРИИ Род Mycobacteriurn (сем. Mycobacteriaceae, порядок Actinomycetales) включает более 100 видов, широко распространенных в природе. Большая часть – сапрофиты и условно-патогенные. У человека вызывают туберкулез (М.tuberculosis – в 92% случаев, М.bovis — 5%, М.africanus – в 3%) и лепру (М.lерrае).

М.tuberculosis – туберкулез – хроническое инфекционное заболевание. В зависимости от локализации выделяют туберкулез органов дыхания и внелегочные формы (кожи, костей и суставов, почек и др.). Локализация зависит от путей проникновения и вида возбудителя.

Морфология. Гр+, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 2–8 и шириной 0,3 мкм. Высокое содержание липидов придает ряд характерных свойств: устойчивость к кислотам, щелочам и спирту, трудное восприятие анилиновых красителей (для окраски применяют метод Циля–Нильсена). В культурах встречаются зернистые формы, ветвящиеся, зерна Муха (шаровидные кислотоподатливые, легко окрашивающиеся по Грамму). Возможен переход в L-формы. Неподвижны, спор и капсул не образуют.

Для размножения используют сложные пит среды, содержащие яйца, глицерин, картофель. Стимулируют рост микобактерий АСП, соли NН4, альбумин, глюкоза, твин-80. Чаще всего применяют среду Левенштейна–Йенсена (яичная среда с добавлением картофельной муки, глицерина и соли) и среду, содержащую АСП, глицерин, цитрат Fe, фосфат калия. Размножаются медленно. Период генерации длителен – деление клеток в оптимальных условиях 1 раз в 14–15ч. Первые признаки роста обнаруживаются через 8–10 дней после посева. Затем на плотных средах появляются морщинистые, сухие с неровными краями колонии. В жидких средах – сначала нежная пленка на поверхности, затем утолщается и падает на дно. Среда при этом остается прозрачной.

АГ. Выделяют белковые, полисахаридные и липидные соединения. АТ образуются на туберкулиновые протеиды, на полисахариды, фосфатиды, корд-фактор. Специфичность АТ определяется в РСК, РНГА, преципитации в геле. АГ состав М.tuberculosis, М.bovis, M.leprae и других микобактерий (включая многие сапрофитические виды) сходен. Туберкулиновый протеин (туберкулин) обладает выраженными аллергенными свойствами.

Экология и распространение. В естественных условиях М tuberculosis вызывает туберкулез у человека, человекообразных обезьян. Из лабораторных животных высокочувствительными являются морские свинки, менее – кролики. К М.bovis – возбудитель туберкулеза у крупного рогатого скота, свиней и человека – высокочувствительны кролики и менее – морские свинки. М.africanus вызывает туберкулез в странах Африки. Путь заражения воздушно-капельный, возбудитель проникает через верхние дыхательные пути, иногда через слизистые оболочки ЖКТ или через поврежденную кожу.

В окружающей среде длительное время сохраняются (в высохшей мокроте – в течение нескольких недель, в воде – более года).

К действию дезинфицирующих веществ более устойчивы, чем другие бактерии Þ требуются более высокие концентрации и более длительное время воздействия. При кипячении погибают мгновенно, чувствительны к УФ.

Патогенез. Источник заражения – люди и животные с активно протекающим туберкулезом, с наличием воспалительных и деструктивных изменений, выделяющие микобактерии. В зоне проникновения и размножения возникает воспалительный очаг (первичный эффект – инфекционная гранулема), наблюдаются сенсибилизация и специфический воспалительный процесс в регионарных лимфоузлах – формируется первичный туберкулезный комплекс. При доброкачественном течении болезни первичный очаг может рассасываться, пораженный участок кальцинироваться и рубцеваться. Но этот процесс не завершается полным освобождением от возбудителя. В лимфоузлах и других органах туберкулезные бактерии сохраняются много лет, иногда в течение всей жизни. Такие люди, с одной стороны, обладают иммунитетом, а с другой – остаются инфицированными.

При сниженной сопротивляемости организма первичный туберкулезный процесс генерализуется. Диссеминация приводит к образованию в различных органах туберкулезных очагов. Характерна интоксикация. При генерализации – поражение органов мочеполовой системы, костей и суставов, мозговых оболочек, глаз.

Не синтезируют экзотоксин. Поражение тканей вызывает ряд веществ – липиды, мураминдипептид, фтионовые кислоты, сульфатиды, туберкулин, возникают специфические гранулемы и поражение тканей. Токсическое действие оказывает гликолипид, так называемый корд-фактор, разрушает митохондрии клеток, нарушает функцию дыхания.

Патогенетически важным является действие на организм инфицированного человека туберкулина. Очищенный от примесей туберкулин (PPD – очищенный протеиновый дериват) является белком. Внутрикожное введение туберкулина вызывает у инфицированных людей местную воспалительную реакцию в виде инфильтрата и покраснения (реакция Манту). Неинфицированные люди реакции на туберкулин не дают. Эту пробу применяют для выявления инфицированных, сенсибилизированных людей.

Иммунитет. Заражение не всегда приводит к развитию заболевания, это зависит от состояния микроорганизмов. Восприимчивость усиливается в неблагоприятных условиях (изнурительный труд, недостаточное и неполноценное питание, плохие жилищные условия и т.д.). Способствуют развитию туберкулезного процесса и эндогенные факторы – сахарный диабет; психические болезни и др. Значение АТ в формировании сопротивляемости к туберкулезной инфекции до сих пор неясно. Считается, что АТ являются «свидетелями» иммунитета и не оказывают ингибирующего действия на возбудитель.

Большое значение имеет клеточный иммунитет. По РБТЛ, цитотоксическому действию лимфоцитов на клетки-«мишени», содержащие АГ микобактерии, выраженности РТММ судят о течении заболевания. Т-лимфоциты после контакта с АГ синтезируют медиаторы, усиливающие фагоцитарную активность макрофагов. При подавлении функции Т-лимфоцитов туберкулезный процесс становится быстротечным и тяжелым.

Микобактерии туберкулеза разрушаются внутриклеточно в макрофагах. Фагоцитоз является одним из механизмов, приводящих к освобождению организма от микобактерии туберкулеза, но он часто незавершенный.

Другой важный механизм – фиксация микобактерий в очагах благодаря образованию инфекционных гранулем при участии Т-лимфоцитов, макрофагов и других клеток. В этом проявляется защитная роль ГЗТ.

Иммунитет при туберкулезе раньше называли нестерильным. Значение имеет не только сохранение живых бактерий, поддерживающих повышенную сопротивляемость к суперинфекции, но и явление «иммунологической памяти». При туберкулезе развивается реакция ГЗТ.

Лабораторная диагностика. Материалом для микробиологического исследования в зависимости от локализации процесса служат мокрота, гной, моча, спинномозговая жидкость, испражнения.

Бактериоскопическое исследование. Мокроту выливают в чашку Петри, ставят на черную поверхность стола, выбирают гнойные комочки, наносят их на предметное стекло и растирают между двумя стеклами. Спинномозговую жидкость для образования пленки фибрина и фиксации в ней микобактерии туберкулеза оставляют на сутки в холодном месте. Затем ее осторожно распределяют на предметном стекле. Мочу центрифугируют для получения осадка. Сделанные мазки окрашивают по Цилю–Нельсену. Микобактерии туберкулеза окрашиваются в ярко–красный (рубиновый) цвет. Если в материале находится небольшое количество микобактерии и в обычных мазках их нельзя обнаружить, применяют методы обогащения.

Метод гомогенизации. Суточную порцию мокроты выливают во флакон или банку, добавляют равный объем 1% водного раствора натрия гидроксида, плотно закрывают резиновой пробкой и энергично встряхивают до, полной гомогенизации (10–15 мин). Утратившую вязкость мокроту центрифугируют, жидкость сливают, осадок нейтрализуют добавлением 2–3 капель 10% соляной кислоты. Из осадка готовят мазки и окрашивают по Цилю–Нельсену.

Метод флотации. Подвергнутую щелочной гомогенизации мокроту для более полного растворения оставшихся слизистых комков помещают на 30 мин на водяную баню при температуре 55°С. Затем к ней добавляют 1–2 мл ксилола (бензола, бензина) и встряхивают в течение 10 мин, потом отстаивают 20 мин при комнатной температуре. Капельки ксилола с адсорбированными микобактериями всплывают, образуя сливкообразный слой, его снимают пипеткой и несколько раз наносят по мере высыхания на предметное стекло. Сделанные мазки тоже окрашивают по Цилю–Нельсену.

Бактериологический метод. Выделить культуру микобактерии туберкулеза удается при наличии в 1 мл исследуемого материала даже 20–100 микробных тел. При этом определяют ее устойчивость к лекарственным препаратам, для того чтобы разработать индивидуальную схему лечения больных.

Выделяя из мокроты культуру микобактерии туберкулеза, к ней в целях уничтожения кислотоподатливой микрофлоры добавляют двойной объем 6% серной кислоты, встряхивают в течение 10 мин, центрифугируют. Затем жидкость сливают, осадок нейтрализуют 1–2 каплями 3% натрия гидроксида или несколько раз отмывают изотоническим раствором натрия хлорида. Нейтрализованные осадки мокроты засевают на скошенную в пробирках яичную среду Левенштейна–Йенсена с малахитовым зеленым, который угнетает рост банальной микрофлоры.

Спинномозговая жидкость, экссудат, гной, кровь кислотно–щелочной обработке не подвергаются, их засевают на среду Левенштейна–Йенсена пипеткой с последующим втиранием бактериальной петлей. Ватные пробки, которыми закрывают засеянные пробирки, заливают парафином, чтобы избежать высыхания среды. Посевы помещают в термостат при температуре 37°С и выдерживают в течение 6–8 недель.

Биологический метод. Животных, чаще морских свинок, заражают для выделения чистых культур микобактерии туберкулеза и изучения патогенеза заболевания. Поскольку большинство изониазидустойчивых штаммов утратило к ним вирулентность, биологический эксперимент в настоящее время не находит широкого применения.

Аллергическая реакция Манту. Выполняют ее путем внутрикожного введения 0,1 мл альт–туберкулина в ладонную поверхность предплечья. Ее результат учитывают через 24–48 ч. В положительных случаях на месте введения туберкулина появляется инфильтрат с венчиком гиперемии диаметром 10 мм, который чаще всего свидетельствует об инфицированности туберкулезом, а у 2–3–летних детей может также являться диагностическим тестом активно развивающейся болезни.

Профилактика и лечение. Для специфической профилактики – живая вакцина БЦЖ-BCG (Bacille Calmette–Guerin). Штамм БЦЖ был получен при длительном пересеивании палочек на картофельно-глицериновой среде с добавлением желчи. За 13 лет была получена культура со сниженной вирулентностью. В нашей стране в настоящее время вакцинируют всех новорожденных на 5–7-й день жизни внутрикожно. Ревакцинация – лицам с отрицательной туберкулиновой пробой с интервалом в 5–7 лет до 30-летнего возраста. Создают т.о. инфекционный иммунитет, при котором возникает реакция ГЗТ. Для лечения – АБ, химиотерапевтические препараты I ряда: тубазид, фтивазид, изониазид, дигидрострептомицин, ПАСК и II ряда: этионамид, циклосерин, канамицин, рифампицин, виомицин. Также проводится десенсибилизирующая терапия и стимуляция естественных защитных механизмов организма.

источник

Понравилась статья? Поделить с друзьями: